Tipps Zur Fehlerbehebung Bei PCR Und Primer-Dimer

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Eine Beschädigungsmeldung kann erscheinen, die darauf hinweist, dass die PCR und das Primer-Dimer höchstwahrscheinlich repariert werden. Es gibt mehrere Möglichkeiten, dieses Problem zu lösen, die wir jetzt besprechen werden.Wir erhöhen die Glühtemperatur.Erhöhen Sie die genaue Zeit/Temperatur im Zusammenhang mit der Denaturierung des Modells.Geringeres Primer-Bewusstsein (10 pmol ist definitiv gut)Verwenden Sie in diesen Produkten einen PCR-Aktivator wie DMSO.Schau dir dein Modell an.Verwenden Sie ein verstärktes Qualitätssiegel.

Zyklusereignis und Temperaturgründe Zu wenige Produkte verwendet Die Verwendung von zu wenigen PCR-Motoren kann zu einer unzureichenden Amplifikation führen. Verwenden Sie 20-35 Runden. Verwenden Sie weniger, wenn die Konzentration für Unterroutinenmuster hoch ist, und erhalten Sie mehr Wert, wenn die Konzentration in Bezug auf Schleifenmuster als niedrig angesehen wird. Die Wiederbelebungszeit war zu kurz Wenn die Off-Shoot-Zeit normalerweise zu kurz ist, haben alle Ziele nicht genügend Zeit, um sich effektiv zu replizieren. Im Allgemeinen möchten Käufer die Verlängerungszeit auf eine brandneue bestimmte Minute/kb. Die Urlaubszeit war ebenfalls kurz Wenn die Glühzeit eines Mädchens zu kurz ist, hat die Grundierung wirklich keine Zeit, sich wieder am Gerät zu befestigen. Verwenden Sie eine effektive Excel-Zeit von mindestens 24 / 7 Sekunden. Die Glühtemperatur war zu hoch Wenn diese Annealingtemperatur hoch ist, werden möglicherweise auch Primer gefunden, die nicht an die Struktur binden können. Typischerweise wird diese bestimmte Glühtemperatur durch eine Verringerung von nur 5°C gegenüber der Tm der Bundesregierung bestimmt. Verwenden Sie das Tool unter www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc, um den Primer zu berechnen, der Tm ist). Niedrigste Tm für Anfänger, wenn die Glühumgebung bestimmt wird. Optimieren Sie diese Art von Glühtemperatur für eine verbesserte Genauigkeit bei der Temperatursteigung. Wenn die Temperatur des m remove 101 von 5 °C nahe an der Verlängerungstemperatur (72 °C) liegt, ziehen Sie die Durchführung eines zweistufigen PCR-Protokolls in Betracht. Die Glühtemperatur sollte unsere eigene Strecktemperatur nicht überschreiten. Denaturierungsbedingungen zu niedrig Wenn die Denaturierungstemperatur sehr niedrig ist, wird sich die DNA hauptsächlich nicht leicht vollständig denaturieren lassen, und die Schalleffizienz kann gering sein. Verwenden Sie einen vertrauenswürdigen 95°C Denaturierungsheizer. Die Denaturierungszeit musste auch lang sein Wenn die Denaturierungszeit immer zu lang ist, kann die DNA zusammenbrechen. Verwenden Sie für die anfängliche Denaturierung derzeit 3 ​​oder mehr Minuten bei 95 °C; für seinen Denaturierungszyklus zu Beginn 30 Sekunden bei 95°C. Die Verzerrungszeit erwies sich bereits als zu kurz
Wenn die Wahrscheinlichkeit einer Denaturierung gering ist, kann die DNA nicht vollständig denaturiert werden, und die Amplifikationseffizienz wird gering. Verbrauchen Sie für die 1. Denaturierung 3 Minuten, um Ihre aktuelle Polymerase zu aktivieren; Um das Layout während des gesamten Zyklus zu verzerren, verwenden Sie 30 Sekunden

Gründe für PCR-Komponenten Die dNTP-Konzentration wird tatsächlich hoch Wenn die Konzentration von dNTP definitiv zu hoch sein muss, Ort der Mg2+-Verarmung. In der Endreaktion muss alles dNTP in einer Geldsumme von 250 µM vorhanden sein. dNTP-Stärke war viel zu niedrig Jeder muss in der spezifischen Endreaktion in einer Konzentration von 200 µM vorhanden sein. PCR hat einen hohen GC-Gehalt im Produkt (>65 %) GC-angereicherte PCR-Produkte sind schwierig zu amplifizieren. Zur Verbesserung der Verstärkung wird durch Glühen das Temperaturniveau verlängert. Passen Sie die Temperatur des Strahls mit dem neuen Temperaturgradienten an, um mehr Details zu erhalten. Sie können DMSO oder zusätzliche Destabilisatoren mit einer gewissen Sekundärstruktur bereitstellen (nicht mehr im Vergleich zu 10 %). Modell wurde beschädigt oder sogar beschädigt oder es können Inhibitoren enthalten sein Matrix, eher total, wird herausgeschnitten oder kann PCR-Inhibitoren enthalten. Bei allgemeinem Verdacht auf Inhibitoren Templat verdünnen; Verwenden Sie andernfalls das saubere Modell und straffen Sie die Fahrräder. Versuchen Sie, eine Kontrollreaktion durchzuführen, indem Sie ein vollkommen reines Plasmid mit Internetauswahl verwenden, um zu entscheiden, ob fast alle hemmenden Wirkungen vorhanden sind. Primer erkannten Verunreinigungen Verunreinigungen in Primern hemmen die PCR. Verwenden Sie demineralisierte Grundierungen sowie Reinigungsgrundierungen. Sie können beide Primer verdünnen, wenn hemmende Wirkungen vorhanden sind, aber fügen Sie durchgehend mindestens 0,02 µM von jedem Primer hinzu. Nicht genug Modell um zu reagieren Unzureichende Verstärkungen treten mühelos auf, wenn die Bahnmenge anfänglich zu gering ist. Erhöhen Sie diese Anzahl von Loopbacks in verschiedenen einfachen Schritten oder erweitern Sie, wenn möglich, den breiten Bereich von Template.DNTP

. Verunreinigungen wurden bereits verwendet Verunreinigungen oberhalb der dNTP-Mischung können zu unvollständiger oder fehlerhafter Amplifikation oder PCR-Hemmung führen. Verwenden Sie hochwertiges dNTP. Primer-Konzentration, aber Informationstechnologie war wirklich hoch Die Verwendung einer erheblichen Konzentration an Primern kann derzeit die Wahrscheinlichkeit erhöhen, dass Primer eine unspezifische Bindung an unerwünschte Dienste im Plus zwischen Arrays zeigen. Verwenden Sie am Ende ähnlich wie bei der Reaktion gut gestaltete Primer 6 bei 2–1 µM. Stellen Sie außerdem sicher, dass alle Hersteller die zuverlässige Menge angegeben haben. Primer-Fokus war zu niedrig Wenn der Fokusbereich zu niedrig ist, könnte das Tempern sicherlich oft ineffizient sein. Verwenden Sie am Ende der Reaktion gut gestaltete Primer in einer Konzentration von 0,2–1 µM. Überprüfen Sie auch, ob die richtige Erkennung bereitgestellt wurde. Enzymspiegel ist zu niedrig Wenn das Polymerase-Target zu niedrig ist, werden alle Nicht-PCR-Produkte vollständig repliziert. Die optimale Dosierung des Enzyms hängt von der Komplexität der Länge und Größe des Artikels ab. Primer enthalten alle vom Benutzer oder Hersteller falsch entworfen oder synthetisiert Stellen Sie sicher, dass spezifische Grundierungen in der richtigen Weise verwendet werden und dem Muster unterliegen. Verwenden Sie das Designprogramm der Bundesregierung, das zurückkehrt, um sich wiederholende Muster, stark komplementäre Bereiche usw. zu vermeiden. Führen Sie eine BLAST-Suche durch, damit Sie Primer entfernen können, die Pseudogene erhöhen oder bestimmte ungünstige Regionen primen können. Verwenden Sie die gesamte Pistole www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc mit Restsalzkonzentration html und damit 0,2–1 µM für Anfänger (je nach Reaktionsbedingungen), um unterwegs Tm< berechnen zu können /sub>. Verwenden Sie die günstigsten Tarife Tm der Primer. Das Ziel war wahrscheinlich sehr lang PCR-Komponentenkonzentrationen und/oder Tiefwasserlaufbedingungen sind für zusätzliche Ziele möglicherweise nicht ausreichend. Optimieren Sie das Design des bestehenden Testangebots erneut und/oder verlängern Sie die Dauer aller PCR-Schritte, insbesondere des Schritts „Hinzufügen“.

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